Distribución de las vesículas de núcleo denso en botones sinápticos del ganglio simpático superior de la rata por efecto de la estimulación eléctrica de alta frecuencia - Ciclos vesiculares

Existen importantes diferencias de origen y funcionales entre las VC y las VND, hablaremos primero de las vesículas claras.

En las VC ha sido posible establecer con bastante claridad su ciclo vesicular aún cuando permanecen desconocidos ciertos aspectos de su funcionamiento. El ciclo vesicular de las VC se inicia con la síntesis en el soma celular de enzimas encargadas de catalizar las proteínas precursoras de los transmisores. Estas enzimas viajan a través de la célula haciendo uso del transporte axónico y llegan al botón terminal donde sintetizan al neurotransmisor que permanece libre en el citoplasma del botón terminal.

Las VC se forman en el compartimiento endosomal (Régnier-Vigouroux y Huttner, 1993) y están conformadas por una membrana lípida que en un principio permanece vacía. Al formarse, la membrana de las VC posee una carga positiva gracias a un protón de hidrógeno, esta carga interactúa con enzimas especiales llamadas transportadores, estas enzimas reciben este nombre debido al papel que juegan dentro del ciclo de las VC. Dicho papel consiste en transportar las moléculas del neurotransmisor del citoplasma al interior de las VC hasta que esta es llenada, lo cual modifica la polaridad de la membrana vesicular y debido a ello los transportadores dejan de actuar sobre ella. Una vez llena, la VC migra hacia los alrededores de la zona activa, donde se integra a un primer grupo de vesículas llamado depósito de reserva. El depósito de reserva es el grupo de vesículas claras que se encuentra más alejado de la zona activa, más cerca de esta se encuentra el depósito liberable y junto a la membrana se puede observar el grupo de vesículas que ya está casi en contacto con la zona activa y lista para realizar la exocitosis, a este conjunto de vesículas se le conoce como depósito anclado.

El presentarse un potencial de acción sólo una fracción de las vesículas (las que corresponden al depósito anclado) descarga su contenido, una vez que estas vesículas descargan las vesículas del depósito liberable se aproximan a la zona activa y pasan a convertirse en el depósito anclado, a su vez las vesículas del depósito de reserva se convierten en el depósito liberable.

Dado que la exocitosis de las vesículas claras es un proceso muy rápido, desde hace décadas se sospechaba de algún mecanismo que ayudaba a fijar (anclar) y preparar la fusión entre las vesículas y la membrana de la célula. Recientemente se han descubierto ciertas proteínas que al parecer revelan este mecanismo que ha recibido el nombre de anclaje. Una vesícula anclada permanece muy cerca de la membrana aunque no entra en contacto directo con ella, lo cual se debe a la compleja interacción entre la vesícula, la membrana y un grupo de proteínas especializadas en anclarlas a la zona activa llamadas SNARE. Cada SNARE cuenta con un péptido lipofílico que lo une a la membrana y una cola de péptidos que se proyectan hacía el citoplasma interior. La vesícula poseen un tipos SNARE llamado v-SNAREs (la v es por vesícula), y la membrana exterior posee un o-SNAREs, (o por objetivo). Estos dos complementarios tipos de SNAREs se vinculan para anclar firmemente a las vesículas a la membrana de la zona activa. Aunque la unión SNARE-con-SNARE forma la principal conexión entre la vesícula y la zonas activas, un grupo de proteínas completan y ciertamente hacen más confusa la comprensión del mecanismo que envuelve el anclaje vesicular. La función de la gran mayoría de estas proteínas es desconocida, pero una proteína vesicular, la sinaptotagmina, puede ser un sensor crítico de CA2+. Al inundar el CA2+ la célula la sinaptotagmina acerca la vesícula clara a la zona activa provocando que ésta rápidamente fusione su membrana con la de la célula y vacíe su contenido hacia el exterior. Los canales de calcio que saturan la zona activa pueden ser parte del proceso de anclaje. La colocación de los canales muy cerca de las vesículas ancladas disparan los neurotransmisores con sorprendente rapidez (menor a los 50 milisegundos) en una sinapsis de mamífero a temperatura corporal normal (Ryan y Reuter, 2001). Al producirse una estimulación sostenida en el botón terminal, los diferentes depósitos de VC se agotan, se dice entonces que las VC están depleciadas (vacías). Debe transcurrir cierto lapso de tiempo para que las vesículas vuelvan a cargarse y los depósitos a formarse.

El proceso de exocitosis es seguido por la endocitosis, durante la cual la membrana vesicular es recuperada y su carga protónica modificada de nuevo para que los transportadores de nuevo actúen sobre ella y vuelvan a llenarla con moléculas del neurotransmisor. Al parecer, los endosomas son una parte importante en el fenómeno de la endocitosis, tanto en le caso de las VC como de las VND (Partoens & Slembrouck 1998). El ciclo vesicular completo de las VC puede observarse en la figura 2.

Figura2. El ciclo vesicular. 1) Una membrana vesicular vacía recién formada por el endosoma entra en contacto con enzimas transportadoras que almacenan los neurotransmisores en su interior, 2) la vesícula se translada a las proximidades de la membrana . 3) la vesícula es "anclada" a la zona activa, por medio de proteínas SNARE, 4) al introducirse los iones de calcio la vesícula libera su contenido en la hendidura sináptica, 5) la vesícula se funde con la membrana y se expande hasta quedar vacía (exocitosis) 6) la vesícula retorna al citoplasma interior (endocitosis), 7) la vesícula vacía modifica su gradiente protónico para que los transportadores vuelvan a 'cargarla' de neurotransmisores.

Por lo general, en el caso de los neurotransmisores, después de realizarse la exocitosis de las vesículas claras se presenta un mecanismo especial que retira el exceso de neurotransmisor que queda libre entre las membranas. Existen varias maneras por las cuales se "limpia" la hendidura sináptica después de una exocitosis pero los más usados son la reabsorción del neurotransmisor por parte de la membrana presináptica y la degradación del transmisor por una enzima específica a ese transmisor.

En contraste con el cuadro claro y hasta cierto punto completo que se puede apreciar en el ciclo de las VC, importantes puntos del ciclo vesicular de las VND son hasta la fecha objeto de intenso debate e investigación. En el caso de las VND se ha comprobado que la liberación de los neuropéptidos se lleva a cabo a través de un proceso de exocitosis, si bien existe la importante diferencia de que las VND no parecen acercarse a la zona activa para descargar su contenido (Chow, 1992; Pow y Morris, 1989; Taxi, 1967). Ejemplos de exocitosis de VND fueron observadas en imágenes de microscopía electrónica, dichas exocitosis ocurrían en zonas no especializadas de la membrana celular (Fillenz, 1971;Pecot-Dechavassine y Brouard, 1997). No existe una explicación al mecanismo de segregación de VND y VC, ni siquiera se sabe si dicho mecanismo existe. Shin et al. (2002) reporta que las VND no requieren de las sinaptotagminas de la zona activa, las cuales son necesarias para la fusión de las VC, no obstante, las VND podrían utilizar algunas proteínas de la membrana como sensores de calcio para "orientarse" hacia la pared celular.

Algunos autores sugieren que las VND se encuentran lejos de la zona activa por el simple hecho de que las VC ya han ocupado ese espacio del botón pero lo cierto es que en los botones terminales cuyas VC han sido depleciadas por estimulación eléctrica las VND no ocupan su lugar. Algunos estudios sugieren que las VND se acomodan cerca de algún depósito interno de Ca2+ como las mitocondrias (Tse y Tse, 1999; Karhunen et al., 2001).

Sin embargo, Somogyi et al. (1984) mostraron que algunas VND son ancladas y realizan su liberación en los bordes de la zona activa en el sistema nervioso central de los mamíferos. Considerando esta información, esta claro que la discusión sobre la morfología de la exocitosis en las VND está lejos de su conclusión. Así pues, las VND y las VC poseen mecanismo de exocitosis semejantes pero no iguales.

A diferencia de las VC, el contenido y la membrana de las VND se sintetizan en el soma, en las zonas externas del aparato de Golgi (Winkler y Fischer-Colbrie, 1990). Las membranas de las VND son llenadas con precursores del neuropéptido, de ahí las VND deben ser transportadas por los microtúbulos del transporte axonal hasta el botón terminal, durante el trayecto, los precursores de su interior sufren transformaciones químicas hasta alcanzar su composición final. Mientras las vesículas claras se fusionan y liberan sus neurotransmisor en la zona activa, las VND realizan su exocitosis en cualquier punto de la membrana y bajo diferentes condiciones pues las VC liberan su neurotransmisor al presentarse cualquier potencial de acción mientras que las VND necesitan de un tren de alta frecuencia en la estimulación para realizar su exocitosis (Lundberg et al., 1994). Bruns y Jahn (1995) en su investigación sobre exocitosis evaluaron el número de moléculas liberadas individualmente tanto en una VC como en una VND en neuronas serotoninérgicas, encontrando que en el caso de las VC se liberaban cerca de 4,700 moléculas en comparación con las 80,000 de una VND en neuronas cultivadas de sanguijuela. Los neuropéptidos que las VND liberan al medio extracelular pueden tener una función inhibitoria o excitatoria en la célula postsináptica y a diferencia de los neurotransmisores no ha sido posible establecer algún mecanismo de degradación o recaptura de los neuropéptidos. La tabla 1 agrupa las principales diferencias entre VC y VND.

Tabla 1. Diferencias entre VC y VND

El hecho de que existan diferencias tan importantes entre estos tipos de vesículas supone que realizan funciones diferentes en la comunicación neuronal. Se ha propuesto que las VC se encargan de mantener una comunicación primaria mientras que los neuropéptidos de los VND modulan con su presencia la facilitación o inhibición de la comunicación neuronal, por este hecho se le ha llamado neuromoduladores.

Figura 3. imagen de microscopia electrónica que muestra un botón terminal con VND un grupo de VC frente a las dos líneas obscuras que conforman la zona activa (ZsA). En el extremo derecho la zona postsináptica (ZP).

¿Pero cómo es que las vesículas "saben" en que momento liberar su carga y cómo el potencial de acción provoca la aparición de la exocitosis?. La liberación, tanto de neurotransmisores como de neuropéptidos es condicionada por la presencia de un elemento particular: el calcio intracelular.

El origen de la despolarización neuronal es la modificación repentina y momentánea de la membrana celular a causa de un potencial de acción. La despolarización de la membrana presináptica por un potencial induce un incremento de los iones de calcio en la zona intracelular, [Ca2+ ]i, y eleva la probabilidad de que se presente la exocitosis en las vesículas sinápticas. Los potenciales de acción pueden tener diferentes formas, esto es, diferentes amplitudes y lapsos temporales, su forma depende del tipo de canal sensible al voltaje y del ion que corresponde a cada canal. Los potenciales de acción más importantes son los dependientes de sodio y los dependientes de calcio. Este último tipo de canal es el responsable del proceso de liberación de neurotransmisores y neuropéptidos en el botón terminal (Hammond, 1996).

La liberación de las VC es discontinua pues las moléculas del neurotransmisor estos están "empacadas" en paquetes llamados quanta, el contenido total de una vesícula sináptica es un quantum (Del castillo y Katz, 1954). Entre los eventos indispensables para la liberación de algún neurotransmisor, el incremento de iones de Ca2+ al interior del botón terminal ha sido firmemente establecido.

En la célula presináptica en reposo la concentración de iones de Ca2+ es muy baja, alrededor de 10-7 M. Esta concentración intracelular de Ca2+ , es al menos diez mil veces más pequeña que la existente en el medio extracelular, los niveles de Ca2+ tanto dentro como en el exterior del botón terminal son creados y mantenidos por mecanismos especiales llamados bombas de calcio, cuya función es mantener bajos los niveles de [Ca2+]i expulsando continuamente los iones de Ca2+ que se encuentran en el citoplasma de la célula. De este modo se crea el escenario para que al abrirse los canales de calcio dependientes del voltaje los iones de Ca2+ inunden el botón terminal y la exocitosis se produzca.

Se ha observado que en un medio extracelular privado de iones de Ca2+ el potencial postsináptico no es observado, aún cuando el potencial presináptico se mantenga sin cambios. Esto se explica porque los canales de calcio dependientes de voltaje se abren pero sin Ca2+ no pueden elevar la carga de iones y por lo tanto la exocitosis no se presenta.

Los canales de calcio se encuentra ubicados estratégicamente en la membrana presináptica, existen canales en toda la membrana del botón pero las concentraciones de canales calcio formando microdominios se pueden observar incrustados en el área de la zona activa, estas concentraciones son al menos diez veces mayores que en otras zonas del botón, explicando así que la secreción de neurotransmisores sea realice de una forma tan rápida.

Al presentarse un potencial de acción los canales de Ca2+ dependientes del voltaje se abren para dejar pasar los iones al interior de la célula, estos iones interactúan con las proteínas SNARES encargadas de anclar y fusionar la membrana de la vesícula con la membrana del botón con el resultado de la expulsión del neurotransmisor a la hendidura sináptica. En el caso de las VND el incremento en la concentración de iones de Ca2+ en el citoplasma intraneuronal también es requisito indispensable para que la exocitosis se presente.