Sujetos
Se utilizaron 12 ratas Wistar (30-40 días), machos adultos divididos en dos grupos de seis sujetos. Los sujetos pesaban entre 200 y 300 grms.
Experimentos
Las ratas se anestesiaron con xilazina (10 mg/Kg i.m.) y ketamina (90 mg/Kg ip.). Se operó a cada sujeto para aislar y estimular in vivo el nervio preganglionar cervical. La estimulación se realizó por sesenta segundos a 40 Hz.
Protocolo
Inmediatamente después de concluida la estimulación, el ganglio se fijó in situ por 15 minutos usando una solución de paraformaldehido al 4% y de glutaraldehido al 2% en solución de fosfato tamponado (PBS) al 0.1 molar. Después de ese lapso el ganglio se extirpo, fue cortado en tres secciones y permaneció por 24 horas en dicha solución.
Se procesó con la técnica de rutina de Microscopia Electrónica (Bachoo, M., Morales M., y Polosa, C. 1992; Morales, M., Bachoo, M., Beaudet, A., Collier, B., y Polosa, C., 1993). En breve el ganglio fue tratado, deshidratado, postfijado con tetra óxido de osmio y puesto en resina para su polimerización. Con un ultramicrotomo se obtuvieron cortes de 75 nm de grosor y dichos cortes fueron observados usando un microscopio electrónico JOEL 210. Los botones sinápticos que contaban con zona activa fueron localizados y se les tomó una micrografía en aumentos que variaban de 25 a 40 mil.
Análisis de las micrografías
Las micrografías obtenidas fueron digitalizadas con un scanner Hewlett-Packard usando el formato tiff. Dado que las imágenes digitalizadas se adquirieron de negativos fue necesario invertir la escala de grises de las mismas, para ello se uso el programa Gimp en su versión 1.3. Con el mismo programa se numeraron las vesículas halladas en cada botón sináptico.
Posteriormente, para realizar el análisis morfométrico se utilizó el programa ImageJ en su versión 1.3. Cada imagen se calibró en nanómetros considerando los aumentos del microscopio electrónico al momento de tomar la foto. Se obtuvieron las distancias entre las VND y la membrana, la mitocondria mas cercana y la zona activa. Además se obtuvo el área de cada botón terminal y el número de vesículas. Los datos fueron almacenados en una base de datos PostgreSQL y se programó una pequeña aplicación en PHP para su consulta en ambiente Web.
Parámetros analizados
Figura 1. Ejemplo de análisis de la distribución de VND en un botón terminal, la línea roja marca el perímetro del botón, la línea azul señala la distancia más cercana entre una VND y la membrana, la línea verde indica la distancia entre una VND y la zona activa señalada.
Los resultados preliminares muestran que la estimulación de alta frecuencia provoca una disminución en la densidad de las VND en los botones sinápticos (de 8,9 a 5,1 vesículas/µm2,p<0.05); así como una disminución significativa en el número de vesículas que se encuentran a 20 nm de la membrana (de 25 a 9 vesículas, p<0.05).
Ejemplos de botones sinápticos
Figura 2. Se muestran ejemplos de botones sinápticos, control y estimulado, en los cuales se señala la membrana del botón (línea continua), las VND, y una distancia de 20 nm de la membrana (línea discontinua). La calibración corresponde a 200 nm.
Distribución y densidad de VND en botones sinápticos
Figura 3. A. Distribución de las VND en relación a la membrana del botón sináptico, se observa una disminución significativa en el número de VND en la cercanía de la membrana (<20 nm). B. Se muestra la densidad de VND en los botones control y estimulado. (En ambos casos * indica p<0.05).
Distribución de VND en relación a la zona activa
Figura 4. Distribución de las VND en relación a la zona activa. Se observa que en los botones controles las VND se distribuyen preferentemente alrededor de 200 nm de la zona activa, mientras que en los botones estimulados las VND se encuentran más alejadas de la zona activa (400-800 nm).
